国内刊号：31-1337/TB
国际刊号：1001-4020
发布日期:
作者：杨晓霞, 龚久平, 杨俊英, 李典晏, 张雪梅, 李必全, 柴勇
关键词：高效液相色谱-串联质谱法, 酶活力, 蚯蚓, 对乙酰氨基酚, 4'-羟基双氯芬酸, 6<i>β</i>-羟基睾酮
按规定方法解剖蚯蚓取得其内脏，经清洗后转移至盛有4 mL匀浆缓冲液的组织研磨器中均匀破碎，并将匀浆体积定为6.0 mL。将此匀浆液通过差速离心法取其微粒体（即第2次离心后的沉淀物）用3 mL保存缓冲液重新悬浮，制得蚯蚓微粒体蛋白悬浮液。将此悬浮液100 μL加入于含孵育体系650 μL及探针底物混合液（含非那西汀100 μmmol·L-1、双氯芬酸钠100 μmmol·L-1和睾酮25 μmmol·L-1）250 μL中，升温至37℃，孵化20 min，加入甲醇200 μL中止反应。离心10 min，取其上清液，经0.22 μm滤膜过滤。所得滤液流经Acquity HPLC C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），并用不同体积比的（A）每升溶液中含甲酸0.5 mL的1 mmol·L-1乙酸铵溶液和（B）甲醇组成的混合液作为流动相进行梯度洗脱，使所加入的3种底物被蚯蚓体内的细胞色素P450亚酶的催化作用而相应产生的3种特异代射物分离。然后在电喷雾正离子源和多反应监测模式条件下，用串联质谱法测得其含量。结果表明：所述3种代谢物（对乙酰氨基酚、4'-羟基双氯芬酸、6β-羟基睾酮）的线性范围依次在0.40，0.20，10.0 μg·L-1以内，检出限（3S/N）依次为0.008，0.005，0.1 μg·L-1。根据所测得3种代谢物的生成量可分别评价蚯蚓体内3种相应的亚酶CYP1A2、CYP2C9和CYP3A4活力。此外，还对受敌敌畏染毒的土壤中培养3 d和14 d后的蚯蚓样品，按上述方法分析，获得了染毒的土壤对蚯蚓体内上述3种CPY亚酶活力的变化情况。所得结果可作为土壤污染全面诊断的生物标记。
来源：2019年第10期
《理化检验-化学分册》期刊编辑部