理化检验-化学分册

作者：孙姗姗, 李婷婷, 陈启, 罗娇依, 李刚, 曹进

关键词：超高效液相色谱-串联质谱法, 酪蛋白, 特征肽段, 胰蛋白酶, 酶解效率

为提高质谱法测定蛋白质的准确性，对酶解条件的优化和选择并建立最佳条件，以期提高回收率。设计了7种酶解方法进行了比较，并引入豆浆作为阴性基质。其中直接酶解法被选为最佳方法，其操作操作过程如下：取1 g豆浆粉溶于10 mL的50 mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中制成豆浆提取液，取200 nmol·L-1 β-酪蛋白溶液200 μL，加入豆浆提取液300 μL，再加10 μg质谱级胰蛋白酶，混匀后于37℃恒温酶解16 h，加入10%（体积分数）甲酸溶液10 μL，终止反应，加水定容至1.0 mL，高速离心10 min，取上清液进样，按仪器工作条件测定VLPVPQK特征肽段的峰面积。此方法的平均酶解效率为106%，相对标准偏差（n=5）为5.1%。方法中选择酶的加入量w酶与β-酪蛋白量wβ-酪蛋白量之比为1∶20。在方法的优化过程中不建议进行还原和烷基化步骤。

来源：2019年第10期

《理化检验-化学分册》期刊编辑部

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